Floura mikroba di lingkungan mana saja pada umumnya terdapat dalam populasi campuran. Bisa dikatakan amat jarang mikroba dijumpai sebagai suatu spesies tunggal di alam. Mencirikan dan mengidentifikasi suatu spesies tunggal tertentu, pertama-tama spesies tersebut harus dapat dipisahkan dari organisme lain yang umum dijumpai dalam habitatnya, lalu ditumbuhkan menjadi biakan murni. Biakan murni adalah biakan yang sel-selnya berasal dari pembelahan suatu sel tunggal. Biakan murni digunakan untuk menelaah dan mengidentifikasi mikroorganisme, termasuk ciri-ciri kultural, morfologis, fisiologis, maupun serologis, memerlukan suatu populasi yang terdiri dari satu macam mikroorganisme saja.
Klasifikasi adalah suatu istilah yang berkaitan dalam pengelompokan-pengelompokan suatu organisme ke dalam taksa yang merupakan kategori dari taksonomi. Penyusunan taksonomi mikroorganisme diharuskan dilakukannya suatu identifikasi. Seluruh kegiatan pengklasifikasian, penamaan, dan pengidentifikasian disebut sistematika mikroba.
1. Taksonomi (klasifikasi): Penataan teratur unit-unit ke dalam kelompok satuan yang lebih besar.
2. Nomenklatur: Penamaan satuan-satuan yang dicirikan dan dibatasi oleh klasifikasi.
3. Identifikasi: Penggunaan kriteria yang ditetapkan untuk klasifikasi dan nomenklatur tersebut
diatas untuk mengidentifikasi mikroorganisme dengan membanding-bandingakan ciri-ciri yang ada pada satuan yang belum diketahui dengan satuan-satuan yang sudah dikenal.
Lactobacillus merupakan salah satu genus bakteri asam laktat yang paling banyak dijumpai pada saluran gastro-intestinal baik pada manusia maupun pada hewan. Lactobacillus di usus halus, jumlahnya dapat mencapai 106–107 sel/g, sedangkan pada usus besar jumlahnya berkisar antara 1010–1011 sel/g. Lactobacillus banyak ditemukan pada produk makanan olahan, baik produk hewani seperti daging dan ikan yang difermentasi, susu fermentasi, maupun pada produk nabati seperti fermentasi sayuran dan buah-buahan.
Bakteri asam laktat didefinisikan sebagai kelompok bakteri yang membentuk asam laktat, baik sebagai satu-satunya produk maupun sebagai produk utama pada metabolisme karbohidrat. Beberapa ciri yang dimiliki oleh bakteri asam laktat adalah termasuk dalam Gram positif, tidak membentuk spora, berbentuk bulat atau batang, dan pada umumnya tidak memiliki katalase, bersifat fakultatif anaerob dan ukurannya sekitar 0,7-1,1 x 2,0-4,0 mikrometer. Bakteri asam laktat juga banyak terdapat pada organ dalam makhluk hidup, seperti pada saluran pembuangan, jalur genital, jalur intestin, maupun jalur respiratori pada manusia dan hewan. Beberapa spesies dari genus ini diantaranya Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus lactis, Lactobacillus casei, dan Lactobacillus ermentum, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus casei dan lain-lain.
Tahap isolasi Lactobacillus sp.
1.Preparasi suspensi dilakukan.
2.Dilakukan pengenceran berseri hingga 10-3. Dua kali pengenceran terakhir disebar sebanyak 0,1 ml pada medium MRSA, selanjutnya inkubasi pada suhu 37oC selama 2x24 jam.
Tahap Pemurnian dengan Metode Streak Kuadran
1.Satu koloni yang nampak terdiri satu tipe sel dipilih.
2.Jarum ose dibakar, setelah dingin disentuhkan ke permukaan koloni bakteri yang akan distreak pada plating MRSA.
3.Streak ini dianggap sebagai streak primer pada permukaan MRSA.
4.Jarum ose dibakar, angkat lalu didinginkan dan distreakan melewati streak primer kesatu atau kedua dan kemudian dilanjutkan streak sekunder tanpa kembali ke streak primer.
5.Jarum ose dibakar, angkat lalu didinginkan dan distreakan melewati streakan sekunder dan kemudian dilanjutkan streak tersier tanpa kembali ke streak sekunder dan primer.
Pengamatan Morfologi Koloni
1.Pengamatan morfologi dilakukan pada koloni tunggal yang terbentuk setelah pemurnian dengan streak kuadran.
2.Bentuk koloni, bentuk tepi, elevasi dan lainnya diamati.
Pembuatan Stok Lactobacillus
Koloni tunggal yang terbentuk setelah pemurnian dengan streak kuadran di tanam pada media MRSA miring.
Pengamatan Morfologi Sel
1. Pengamatan morfologi sel dilakukan melalui teknik pewarnaan Gram
2. Ambil Isolat dari stok dan goreskan diatas object glass.
3. Biakan lalu difiksasi, setelah itu diberi Gram A (crystal violet) selama 60 detik.
4. Dicuci dengan air mengalir kemudian dikeringkan.
5. Diberi Gram B (iodin) selama 60 detik.
6. Dicuci dengan air mengalir kemudian dikeringkan.
7. Diberi Gram C (Alkohol 96%) sampai tetesan akhir berwarna bening.
8. Dicuci dengan air mengalir kemudian dikeringkan.
9. Diberi Gram D (safranin) selama 45 detik.
10. Dicuci dengan air mengalir kemudian dikeringkan.
11. Diamati dibawah mikroskop cahaya.
Uji Motilitas
1. Isolat dari stok ditanam pada MRSA tegak.
2. Inkubasi suhu 37oC selama 2x24 jam.
3. Diamati motilitas dari pertumbuhan bakteri yang terbentuk.
Uji Penggunaan Oksigen
1. Isolat dari stok ditanam pada MRSA tegak.
2. Inkubasi pada suhu 37oC selama 2x24 jam.
3. Diamati penggunaan oksigen dari pertumbuhan bakteri yang terbentuk.
Uji ketahanan Suhu
1. Isolat dari stok ditanam pada MRSB di tabung.
2. Inkubasi 37oC selama 2x24 jam.
3. Diamati ketahanan suhu dari hasil inkubasi apakah terjadi pertumbuhan bakteri atau tidak.
Uji VP (Voges Proskauer)
1. Bakteri uji ditumbuhkan pada medium cair MR-VP sebanyak 1 ose.
2. Bakteri uji diinkubasi selama 2x24 jam pada temperatur 37oC.
3. Bakteri uji ditetesi KOH 40% sebanyak 3 tetes dan α-naftol sebanyak 3 tetes.
4. Hasil positif jika terbentuk kompleks warna pink.
Uji Katalase
1. Preparat ulas bakteri uji dibuat.
2. Preparat ulas ditetesi dengan reagen H2O2.
3. Perubahan diamati, hasil positif jika terbentuk gelembung gas dan hasil negatif jika tidak terbentuk gelembung gas.
Uji Manosa dan Raffinosa
1. Bakteri uji ditumbuhkan pada medium Galaktosa, Manosa, dan Raffinosa.
2. Bakteri uji diinkubasi selama 2x24 jam pada temperatur 37oC.
3. Perubahan diamati, hasil positif jika media berubah warna dari ungu menjadi kuning dan hasil negatif jika media tetap berwarna ungu.
Uji Reduksi Nitrat
1. Bakteri uji ditumbuhkan pada medium cair Nitrate Broth sebanyak 1 ose.
2. Bakteri uji diinkubasi selama 2x24 jam pada temperatur 37oC.
3. Diamati terbentuknya gelembung gas pada tabung durham.
4. Bakteri uji ditetesi 1 ml (20tetes) Nitrat Reagent A dan dilanjutkan 1 ml Reagent B.
5. Hasil positif jika terbentuk warna merah tua.
6. Jika tidak terbentuk warna merah tua selama 5 menit ditambah bubuk seng dan didiamkan, jika terbentuk warna merah menandakan uji negatif dan jika tidak terbentuk warna merah menandakan uji positif.
Penentuan Spesies Melalui Pendekatan Homologi
Data-data yang telah diperoleh dibandingkan dengan data karakter dari bakteri yang telah diketahui.
Menentukan persen homologi dengan rumus :
%homologi= jumlah karakter yang sama dibagi dengan jumlah karakter yang diuji dikalikan 100%.
Bakteri digolongkan menjadi dua, yaitu bakteri yang menguntungkan dan bakteri yang merugikan. Bakteri asam laktat (BAL) merupakan bakteri yang menguntungkan (Sardjoko, 1991). Bakteri asam laktat didefinisikan sebagai kelompok bakteri yang membentuk asam laktat, baik sebagai satu-satunya produk maupun sebagai produk utama pada metabolisme karbohidrat. Beberapa ciri yang dimiliki oleh bakteri asam laktat adalah termasuk dalam Gram positif, tidak membentuk spora, berbentuk bulat atau batang dan pada umumnya tidak memiliki katalase (Hasan, 2006).
Isolasi adalah memisahkan suatu mikroorganisme dari campurannya sehingga didapat kultur murni. Biakan murni terdiri dari suatu populasi sel yang semuanya berasal dari satu sel induk (Pelczar, 2006). Mikroba yang digunakan dalam isolasi dan identifikasi adalah Lactobacillus sp. yang diambil dari usus ayam. Mikroba diisolasi dalam media MRSA (De Man Rogosa Sharpe Agar). Komposisi media MRSA adalah pepton 10 g, beef extract 10 g, yeast extract 5 g, K2HPO4 2 g, amonium sitrat 2 g, glukosa 2 g, sodium asetat 3H2O 20 g, MgSO4 7H2O 0,58 g, MnSO4 4H2O 0,28 g, agar 15 g, akuades 1000 ml (Oxoid, 1982).
Lima gram sampel ditambahkan ke dalam 45 ml akuades steril dengan cara rinse (merupakan pengenceran 10-1). Dilakukan pengenceran berseri hingga pengenceran10-3. Pengenceran 10-2 dan 10-3 diisolasi dengan menggunakan media MRSA dengan metode sebaran (speard plate) secara duplo. Kultur tersebut diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Kultur murni ditumbuhkan pada media dengan metode streak kuadran dan disimpan pada media MRSA miring untuk peremajaan. Isolat yang diperoleh dilakukan identifikasi dengan pengamatan koloni tunggal dan morfologi stok, katalase, uji motilitas, uji penggunaan O2, uji suhu, uji KH (karbohidrat), TSIA (Triple Sugar Iron Agar), uji NR (Nitrate Reduktase), uji VP (Voges Proskauer) dan dihitung persen homologinya. Isolasi BAL ini digunakan media isolasi yang spesifik yang sering disebut sebagai media selektif. Media selektif ini digunakan untuk menumbuhkan dan memelihara bakteri tertentu. Sifat kekhususannya maka akan menyeleksi BAL secara langsung. Media selektif hanya bakteri tertentu yang dapat tumbuh yaitu media MRSA (Oxoid, 1982).
Hasil yang didapat dalam pengamatan morfologi koloni Lactobacillus sp. adalah sebagai berikut :
Margin : Rata
Elevasi : Konveks
Bentuk koloni : Kecil
Warna : Putih susu
Permukaan : Halus mengkilap
Pewarnaan Gram menurut Hadioetomo (1985), Preparat ulas dibuat pada gelas benda, difiksasi di atas api bunsen. Preparat ditetesi dengan larutan kristal ungu, didiamkan selama 60 detik dan dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Preparat ditetesi dengan larutan iodin dan didiamkan selama 2 menit, dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Preparat ditetesi dengan alkohol 96% sampai warna ungu hilang. Preparat ditetesi safranin dan didiamkan selama 30 detik, dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Preparat ditetesi dengan minyak imersi. Preparat diamati dengan mikroskop, uji gram positif jika sel berwarna ungu dan negatif jika sel berwarna merah. Hasil yang didapat dalam pewarnaan Gram Lactobacillus sp. adalah Gram positif (sel berwarna ungu).
Lactobacillus sp. merupakan kelompok dari Gram positif karena memiliki lapisan peptidoglikan yang tebal sehingga ketika diberi pewarna pebanding yaitu safranin tidak berubah warna, tetap berwarna ungu (warna utama). Alkohol dalam pewarnaan Gram berfungsi sebagai pelarut lemak. Kristal violet sebagai pewarna primer (Pelczar, 2006). Bakteri asam laktat termasuk kedalam kelompok Gram Positif (Stamer, 1979).
Teknik pewarnaan Gram pertama kali diuraikan oleh seorang bakteriologiwan Denmark, Christian Gram. Warna yang berbeda pada kelompok bakteri disebabkan karena komposisi dari dinding sel bakterinya. Dinding sel yang lebih tebal pada Gram positif menyusut oleh perlakuan alkohol karena terjadinya dehidrasi, menyebabkan pori-pori dinding sel menutup sehingga mencegah larutnya kompleks ungu kristal-iodium pada langkah pemucatan. Sel-sel Gram negatif mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi pada dindingnya.
Lipid pada umumnya larut dalam alkohol dan aseton. Larutnya lipid oleh pemucatan yang digunakan dalam pewarnaan Gram yang dapat memperbesar pori-pori dinding sel dan sel menjadi tak berwarna sehingga ketika diberi safranin sel akan menyerap pewarna ini menjadi warna merah (Hadioetomo, 1993).
Uji motilitas menurut Barrow et al., (1993), Isolat dari agar miring ditusukkan pada agar tegak semi solid SIMA (Sulphide Indole Motility Agar) kemudian diinkubasi selama 48 jam pada suhu 30oC. Diamati uji motilitas bakteri. Uji motilitas positif jika pertumbuhan koloni menyebar luas pada agar. Hasil yang didapat dalam uji motilitas Lactobacillus sp. adalah tidak motil sesuai dengan Hasan (2006) yang menyatakan Lactobacillus memiliki ciri yang tidak motil.
Uji penggunaan oksigen isolat dari agar miring ditusukkan pada agar tegak MRSA di permukaan, tengah dan dasar medium. Diamati uji penggunaan oksigen.
Aerob jika biakan hanya berada di permukaan agar, anaerob jika biakan hanya berada di dasar dan fakultatif anaerob jika biakn berada dipermukaan dan tengah. Hasil yang didapat dari uji penggunaan oksigen adalah Lactobacillus sp. bersifat fakultatif anaerob sesuai dengan Stamer (1979) yang menyatakan Lactobacillus sp
bersifat fakultatif anaerob.
Uji ketahanan suhu isolat dari agar miring dilarukan kedalam dua media MRS broth dan diinkubasi dengan suhu 15oC dan 45oC selama 48 jam. Diamati jika media keruh menandakan adanya bakteri. Hasil yang di dapat adanya bakteri pada medium dengan pemakaian suhu 45oC. Menurut Stamer (1979) bakteri asam laktat merupakan bakteri mesofilik.
Uji VP (Voges Proskauer) menurut Hadioetomo (1993), pada sisa biakan dalam medium MR-VP ditambahkan reagen Barritt yaitu 10 tetes larutan A dan 10 tetes larutan B. Larutan A berisi α-naftol 6 g dan etanol (95%) 100 ml, larutan B berisi KOH 16 g dan A ir suling 100 ml. Tabung dikocok keras-keras selama 20-30 detik. Bila terlihat warna merah muda artinya terjadi pembentukan 2,3-butanadiol atau reaksi Voges-Proskauer positif. Kadang-kadang diperlukan waktu 2 jam untuk memperoleh hasil dari uji ini. Sesungguhnya tidak ada uji yang dapat
Secara langsung medeteksi adanya 2,3-butanadiol di dalam biakan. Namun reagen Barritt dapat dengan mudah medeteksi asetoin (asetil-metil karbinol), yaitu prekursor 2,3-butanadiol. Bila reagen ini ditambahkan pada biakan MR-VP berumur 48 jam dan setelah dibiarkan beberapa waktu lamanya terlihat perubahan warna medium menjadi merah muda atau merah, maka artinya dalam biakan tersebut terdapat asetoin. Asetoin dan 2,3-butanadiol hampir selalu terdapat bersama-sama maka uji ini dianggap sah. Metode tak langsung yang menguji ada tidaknya 2,3-butanadiol ini disebut Voges-Proskauer. Hasil uji VP adalah negatif atau tidak terbentuk warna merah atau merah muda.
Uji katalase menurut Lay (1994), isolat dari agar miring diambil satu ose, kemudian dioleskan pada gelas benda yang telah diberi alkohol. Gelas benda ditetesi dengan larutan H2O2 3%. Diamati terbentuknya gelembung gas pada preparat. Jika terdapat gelembung gas berarti uji katalase tersebut positif.
Kebanyakan bakteri aerob dan aerob fakultatif yang manggunakan oksigen menghasilkan hidrogen peroksida yang bersifat racun bagi sistem enzimnya sendiri, namun mereka dapat tetap hidup dengan adanya antimetabolik tersebut karena dihasilkannya enzim katalase yang dapat mengubah hidrogen peroksida menjadi air dan oksigen :
2H2O2 ----> 2 H2O + O2
Matinya bakteri-bakteri anaerob obligat bila ada oksigen disebabkan karena tidak adanya pembentukan enzim katalase sehingga H2O2 meracuni bakteri itu sendiri (Hadioetomo, 1993). Hasil yang didapat adalah tidak menghasilkan katalase (negatif).
Uji Manosa dan Raffinosa diawali dengan mengambil isolat dari agar miring dan dimasukkan ke dalam 3 media MRSB yang masing-masing ditambah BCP (Brom Cresol Purple) sebagai indikator asam dan jenis karbohidrat yang berbeda yaitu galaktosa, manosa dan raffinosa kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Diamati perubahan warnanya. Positif jika berwarna kuning yang menandakan terjadinya proses fermentasi dan negatif jika berwarna tetap atau ungu. Hasil yang didapat adalah ketiganya positif.
Uji reduktase nitrat dimulai mengambil isolat dari tabung miring dan memasukkannya ke dalam media Nitrate Broth sebanyak 1 ose. Diinkubasi 37oC selama 48 jam. Setelah itu ditetesi @ 1 ml atau sama dengan 20 tetes Reagen A dan Reagen B. Reagen A memiliki komposisi berupa sulfanilic acid 8 g dan 5 N acetic acid 1000 ml, sedangkan Reagen B memiliki komposisi berupa diemethyl-α-naphthylamine 5 g dan 5 N acetic acid 1000 ml. Meskipun sampai kini masih belum diketahui secara pasti, namun ada kemungkinan bahwa diemethyl-α-naphthylamine dalam Reagen B bersifat karsinogenik (dapat menimbulkan kanker) (Hadioetomo,1993).
Banyak bakteri anaerob fakultatif dapat menggunakan nitrit. Reaksi enzimatik ini dikendalikan oleh suatu enzim indusible yang disebut nitratase :
NO3- + 2e- + 2H+ ---> NO2- + H2O
Karena adanya oksigen menghambat terjadinya reduksi nitrat, organisme yang tumbuh aktif akan menghabiskan oksigen yang tersedia lebih dahulu, baru kemudian menggunakan nitrat. Kadang-kadang nitrit yang terbentuk di dalam biakan mengalami reduksi lebih lanjut menjadi gas N2. Penambahan reagen ke dalam biakan tidak menimbulkan warna, karena itu uji yang tampak negatif dapat berarti betul-betul negatif (tidak terjadi pembentukan nitri) tetapi dapat pula merupakan uji yang sesungguhnya positif namun nitrit yang terbentuk sudah mengalami reduksi lebih lanjut. Hal ini dapat diperiksa dengan menambahkan debu seng. Bila terbentuk warna merah artinya uji tersebut betul-betul negatif karena seng bereaksi dengan nitrat yang tidak tereduksi, bila tetap tidak terjadi perubahan warna maka artinya uji tersebut sesungguhnya positif karena nitrat telah tereduksi secara lanjut dan tidak tersedia lagi untuk bereaksi dengan seng (Hadioetomo,1993). Hasil yang didapat adalah positif.
Uji TSIA diawali dengan mengambil isolat dari agar miring kemudian ditusukkan kedalam media miring MRSA dan digoreskan sesuai kemiringan agar. Diinkubasi selama 48 jam dengan suhu 37oC. Diamati perubahan terhadap media agar. Terdapat 5 interprestasi dari TSIA yaitu :
Jika slan dan but berwarna tetap (merah : tidak terjadi fermentasi glukosa, sukrosa dan laktosa.
Jika slan merah dan but kuning : terjadi fermentasi glukosa saja.
Jika slan dan but berwarna kuning : terjadi fermentasi glukosa, laktosa dan sukrosa.
Jika slan merah dan but kehitaman : terdapat H2S sebagai hasil sampingan metabolisme protein.
Jika but terangkat atau rusak : terdapat gas sebagai hasil sampingan fermentasi.
Hasil yang didapat adalah slan dan but berwarna merah menandakan tidak terjadinya fermentasi glukosa, sukrosa dan laktosa. Adapun komposisi dari media TSIA adalah glukosa 1%, laktosa 0,1 % dan sukrosa 0,1 %. FeSO4 dan pepton.
Tabel 1. Hasil Identifikasi Isolat Lactobacillus dari Usus Ayam.
No.Uji 1 2 3 4
1.Suhu 45oC + + + +
15oC - - - -
2.Karbohidrat Raffinosa + + + -
Manosa + + -
Galaktosa + + +
3. TSIA Glukosa - + + +
Laktosa - + + +
Sukrosa - + - +
4. Voges Proskauer -
5. Reduksi Nitrat +
6. Motilitas - - - -
7. Penggunaan O2 FA FA FA FA
8. Pewarnaan Gram + + + +
9. Katalase - - - -
Keterangan :
1 = Lactobacillus yang diuji dari usus ayam
2 = Lactobacillus acidophilus
3 = Lactobacillus bulgaricus
4 = Lactobacillus casei
Menurut Hasan (2006) bakteri yang dapat diisolasi dari usus ayam adalah Lactobaciilus murinus dan Lactobacillus acidophilus. Hasil yang didapat Lactobacillus uji diduga merupakan lactobacillus bulgaricus karna %Homologinya yang lebih besar dibanding yang lainnya.
Tidak ada komentar:
Posting Komentar